發(fā)酵飼料分析檢測(cè)技術(shù)

   日期:2019-12-31     來(lái)源:當(dāng)代化工    作者:陳影,盧宗梅、張琳、徐曉然、王梅、佟毅;    瀏覽:448    評(píng)論:0    
核心提示: 近年來(lái),生物飼料研究與應(yīng)用已經(jīng)成為飼料行業(yè)研究的熱點(diǎn)?!掇r(nóng)業(yè)部十三五規(guī)劃》也明確提出生物飼料產(chǎn)業(yè)對(duì)促進(jìn)農(nóng)副資源飼料化與
  近年來(lái),生物飼料研究與應(yīng)用已經(jīng)成為飼料行業(yè)研究的熱點(diǎn)?!掇r(nóng)業(yè)部“十三五”規(guī)劃》也明確提出生物飼料產(chǎn)業(yè)對(duì)促進(jìn)農(nóng)副資源飼料化與高效利用、推動(dòng)飼料配方體系的變革、改善動(dòng)物生產(chǎn)性能、降低養(yǎng)殖成本、實(shí)現(xiàn)從減抗到無(wú)抗養(yǎng)殖、減排環(huán)保等具有重要意義。生物飼料是未來(lái)發(fā)展方向,目前我國(guó)從事生物飼料行業(yè)的企業(yè)數(shù)量已經(jīng)有1000 多家,微生物飼料添加劑和酶制劑產(chǎn)量已經(jīng)超過(guò)20 萬(wàn)t,發(fā)酵飼料產(chǎn)品產(chǎn)量110 多萬(wàn)t,增幅超過(guò)20%。國(guó)家對(duì)于發(fā)酵飼料的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與控制,也在不斷的規(guī)范發(fā)展。生物飼料領(lǐng)域第1 個(gè)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)T /CSWSL 001—2018《生物飼料產(chǎn)品分類(lèi)》于2018 年1 月1 日發(fā)布,《發(fā)酵飼料技術(shù)通則》、《飼料原料釀酒酵母培養(yǎng)物》、《飼料原料釀酒酵母發(fā)酵白酒糟》和《飼料添加劑植物乳桿菌》4 項(xiàng)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)于2018 年9 月7 日發(fā)布,對(duì)規(guī)范我國(guó)生物飼料產(chǎn)業(yè)自律性和行業(yè)健康發(fā)展意義重大。
  1 飼料原料
  1.1 發(fā)酵飼料
  《飼料原料目錄》中含有12 類(lèi):谷物及其加工產(chǎn)品,油料籽實(shí)及其加工產(chǎn)品,豆科作物籽實(shí)及其加工產(chǎn)品,塊莖、塊根及其加工產(chǎn)品,其它籽實(shí)、果實(shí)類(lèi)產(chǎn)品及其加工產(chǎn)品,飼草、粗飼料及其加工產(chǎn)品,其它植物、藻類(lèi)及其加工產(chǎn)品,乳制品及其副產(chǎn)品,陸生動(dòng)物產(chǎn)品及其副產(chǎn)品,魚(yú)、其它水生生物及其副產(chǎn)品,礦物質(zhì),微生物發(fā)酵產(chǎn)品及副產(chǎn)品。生物飼料,總體來(lái)講,要使用在我們?cè)试S的飼料目錄和添加劑里的原料,通過(guò)生物工程技術(shù),進(jìn)行處理,包括發(fā)酵飼料、酶解飼料、菌酶協(xié)同發(fā)酵飼料和生物飼料添加劑。使用《飼料原料目錄(2013)》和《飼料添加劑品種目錄(2013)》等國(guó)家相關(guān)法規(guī)允許使用的飼料原料和微生物,通過(guò)發(fā)酵工程技術(shù)生產(chǎn)、含有微生物或其代謝產(chǎn)物的單一飼料和混合飼料。鑒于生物飼料添加劑種類(lèi)繁多,本文僅就發(fā)酵飼料的檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行綜述。1.2 常規(guī)檢測(cè)指標(biāo)《GB/T 6435 飼料水分的測(cè)定》、《GB/T 12456 食品中總酸的測(cè)定》、《GB/T 6432 飼料中粗蛋白測(cè)定方法》、《GB/T 643 飼料中粗脂肪的測(cè)定》、《GB/T 6434飼料中粗纖維的含量測(cè)定過(guò)濾法》、《GB/T 6438 飼料中粗灰分的測(cè)定》、《GB/T 18246 飼料中氨基酸的測(cè)定》、《GB/T 22492 大豆肽粉》、《GB/T 6439 飼料中水溶性氯化物的測(cè)定》、《GB/T 13885 飼料中鈣、銅、鐵、鎂、錳、鉀、鈉和鋅含量的測(cè)定》、《GB/T 20806飼料中中性洗滌纖維(NDF)的測(cè)定》、《NY/T 1459 飼料中酸性洗滌纖維的測(cè)定》、《GB/T 17817 飼料中維生素A 的測(cè)定 高效液相色譜法》、《GB/T 20194 動(dòng)物飼料中淀粉含量的測(cè)定 旋光法》。
  1.3 衛(wèi)生指標(biāo)
  《GB 13078 飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》、《GB/T 13079 飼料中總砷的測(cè)定》、《GB/T 13080 飼料中鉛的測(cè)定》、《GB/T13092 飼料中霉菌總數(shù)測(cè)定方法》、《GB/T17480 飼料中黃曲霉毒素B1 的測(cè)定方法》、《GB/T 30956 飼料中DON 測(cè)定》、《GB/T 28716 飼料中玉米赤霉烯酮的測(cè)定》、《GB/T 18869 飼料中大腸菌群的測(cè)定》。
  1.4 微生物指標(biāo)
  《GB/T20191 飼料中嗜酸乳桿菌的微生物學(xué)檢驗(yàn)》、《GB/T26428 飼用微生物制劑中枯草芽孢桿菌的檢測(cè)》、《 NY/T 2131 飼料添加劑 枯草芽孢桿菌》、《NY/T 1461 飼料微生物添加劑地衣芽孢桿菌》、《NY/T 1969 飼料添加劑 產(chǎn)朊假絲酵母》、《GB/T22547 飼料添加劑 飼用活性干酵母》、《GB 4789.2 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》。
  1.5 規(guī)則規(guī)范
  《飼料原料目錄》、《飼料添加劑品種目錄》、《飼料添加劑安全使用規(guī)范》、《JJF1070 定量包裝商品凈含量計(jì)量檢驗(yàn)規(guī)則》、《定量包裝商品計(jì)量監(jiān)督管理辦法》、《GB 10648 飼料標(biāo)簽》、《GB/T 14699.1 飼料采樣》、《GB/T 16764 配合飼料企業(yè)衛(wèi)生規(guī)范》、《GB/T 10647 飼料工業(yè)術(shù)語(yǔ)》、《GB/T 20195 動(dòng)物飼料 試樣的制備》、《GB/T 18823 飼料檢測(cè)結(jié)果判定的允許誤差》。
  1.6 延伸檢測(cè)指標(biāo)
  《GB/T 5009.157 食品中有機(jī)酸的測(cè)定》、《NY/T2796 水果中有機(jī)酸的測(cè)定 離子色譜法》、《GB/T23881 飼用纖維素酶活性的測(cè)定 濾紙法》、《NY/T912 飼料添加劑 纖維素酶活力的測(cè)定分光光度法》、《 GB/T 28715 飼料添加劑酸性、中性蛋白酶活力的測(cè)定 分光光度法》、《NY/T 1372-2007 飼料中三聚氰胺的測(cè)定》。
  2 關(guān)鍵檢測(cè)項(xiàng)目
  2.1 酸度
  2.1.1 分類(lèi)
  可以采用化學(xué)滴定法和液相色譜法測(cè)定。化學(xué)滴定法測(cè)定的是游離酸,結(jié)果以乳酸計(jì)(游離酸中乳酸占主導(dǎo));液相色譜法測(cè)定的是游離酸與有機(jī)酸鹽,結(jié)果是以游離酸含量計(jì)。如果液相色譜法存在分離度低的情況時(shí),可以用生物傳感分析儀等其他方法對(duì)乳酸和乙酸進(jìn)行測(cè)定。
  2.1.2 化學(xué)滴定法
  (1)樣品處理:取有代表性樣品至少200g,放入粉碎機(jī)粉碎,使其能完全通過(guò)40 目篩孔,充分混合。稱(chēng)取1~2g 試樣,精確至0.0001g,置于100mL 燒杯中,加入100mL 無(wú)二氧化碳水,加入轉(zhuǎn)子,在磁力攪拌器上攪拌10min,使試樣中的有機(jī)酸全部溶解于溶液中。(2)測(cè)定過(guò)程方法一:待測(cè)定溶液中加入0.2mL1%的酚酞指示劑,用0.1mol/L 氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液滴定至微紅色30s不褪色。記錄消耗的標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積。方法二:用pH 值指示終點(diǎn), 0.1mol/L 氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液滴定控制pH 在8.0~10.0 之間。記錄消耗的標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積。(3)結(jié)果處理根據(jù)酸堿中和原理和化學(xué)反應(yīng)的計(jì)量關(guān)系,計(jì)算氫離子含量,結(jié)果以乳酸計(jì)。計(jì)算結(jié)果表示到小數(shù)點(diǎn)后兩位。同一樣品兩次測(cè)定結(jié)果之差,不得超過(guò)兩次測(cè)定平均值的2%。
  2.1.3 液相色譜法
  有機(jī)酸的測(cè)定方法有離子色譜法、毛細(xì)管電泳法、氣相色譜法等;HPLC 法具有方法簡(jiǎn)單,分析速度快,靈敏度高的特點(diǎn)。因飼料原料與發(fā)酵產(chǎn)物成分的復(fù)雜性,導(dǎo)致組分分離度低,造成測(cè)定結(jié)果偏高的現(xiàn)象。此時(shí)可以用兩種色譜柱分別進(jìn)行檢測(cè),進(jìn)行對(duì)比。一種方法是用C18 柱(GB/T 5009.157 食品中有機(jī)酸的測(cè)定),還可以采用有機(jī)酸氫柱進(jìn)行分析,參數(shù)如下:色譜柱:Aminex HPX-87H, 300 mm×7.8 mm;保護(hù)柱: Micro-Guard Cation H cartridge,30×4.6mm;流動(dòng)相: 0.005 mol/LH2SO4;溫 度: 65 ℃;流 速:0.6 mL/min;進(jìn)樣量: 15μL;檢測(cè)器: 示差折光檢測(cè)器;分析時(shí)間: 30 min。
  2.1.4 生物傳感分析儀法
  SBA-40D 型生物傳感分析儀利用酶促反應(yīng)來(lái)進(jìn)行定量分析,測(cè)定的關(guān)鍵傳感器是固定化酶和H2O2 電極復(fù)合傳感器。樣品經(jīng)稀釋到合適的濃度范圍,用進(jìn)樣針從進(jìn)樣口注入反應(yīng)池內(nèi),由反應(yīng)池?cái)嚢柘到y(tǒng)混勻?;靹虻臉悠吠高^(guò)固定化酶?jìng)鞲衅鞯闹文?,在酶的催化下發(fā)生上式所示的生化反應(yīng),產(chǎn)生H2O2 。因?yàn)榉磻?yīng)池恒體積,每次進(jìn)樣量也固定,所以反應(yīng)池內(nèi)樣品濃度與進(jìn)樣樣品濃度是固定的比例關(guān)系。酶反應(yīng)放出的H2O2 透過(guò)酶膜的內(nèi)層在鉑金電極表面失去電子還原成H2O,鉑電極獲得電子產(chǎn)生電流信號(hào),該電流信號(hào)與H2O2 的濃度成比例,而H2O2 濃度與底物濃度成線(xiàn)性比例關(guān)系。通過(guò)比較被測(cè)物和標(biāo)準(zhǔn)樣品產(chǎn)生的H2O2 量,就可計(jì)算出被測(cè)樣品中底物的含量。分析過(guò)程基于以下生化反應(yīng)(表1):
  2.2 益生菌
  枯草芽孢桿菌和乳酸菌、酵母菌有區(qū)別,它在發(fā)酵飼料中存在營(yíng)養(yǎng)體與芽孢體。如果測(cè)定樣品中芽孢體可全部參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的樣品處理方法,如果測(cè)定樣品中的總數(shù),則不能將樣品80 ℃水溶處理,因?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)體在此條件下能被滅活。單一微生物的計(jì)數(shù)方法均可參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn),但對(duì)于添加多種微生物的發(fā)酵飼料,由于微生物之間的相互作用,造成平板上菌落類(lèi)型多、計(jì)數(shù)低的情況,進(jìn)而對(duì)質(zhì)量無(wú)法進(jìn)行準(zhǔn)確判斷。因此根據(jù)微生物特性,對(duì)樣品迚行預(yù)處理和選擇合適的培養(yǎng)基,能準(zhǔn)確檢測(cè)益生菌數(shù)量。發(fā)酵飼料中枯草芽孢桿菌用水稀釋后在NA 平板上涂布,嗜酸乳桿菌用50mg/L 納他霉素溶液稀釋后在MRS 平板上涂布,產(chǎn)朊假絲酵母菌用水稀釋后在孟加拉紅平板上涂布(圖1-3)。
  2.3 蛋白質(zhì)
  2.3.1 分類(lèi)
  含氮物質(zhì),分為無(wú)機(jī)氮和有機(jī)氮。有機(jī)氮可分為水溶性有機(jī)氮和水不可溶性有機(jī)氮,也可分為酸溶性有機(jī)氮和酸不溶性有機(jī)氮。在飼料發(fā)酵過(guò)程中,關(guān)注的指標(biāo)是無(wú)機(jī)氮、水溶性有機(jī)氮、酸溶性有機(jī)氮、游離氨基酸、總氨基酸。
  2.3.2 無(wú)機(jī)氮
  無(wú)機(jī)氮是非蛋白氮,其含量的高低影響飼料中粗蛋白的含量。樣品不需要消解,可直接測(cè)定或用水或酸溶解后測(cè)定清液。
  2.3.3 有機(jī)氮
  水溶性有機(jī)氮:精確稱(chēng)取一定量的樣品(40 目通過(guò)率100%),用水溶解,混勻作靜置5 min,過(guò)濾,去除初濾液,濾液作為待測(cè)液。樣品消解后測(cè)定總氮,減去水溶性無(wú)機(jī)氮。酸溶性有機(jī)氮:精確稱(chēng)取一定量的樣品(40 目通過(guò)率100%),用15%的三氯乙酸溶液溶解,混勻幵靜置5 min,過(guò)濾,去除初濾液,濾液作為待測(cè)液。樣品消解后測(cè)定總氮,減去酸溶性無(wú)機(jī)氮。
  2.3.4 氨基酸
  游離氨基酸:精確稱(chēng)取一定量的樣品(40 目通過(guò)率100%),用pH=2.2 的檸檬酸鈉緩沖溶液溶解混勻幵靜置5 min,過(guò)濾,去除初濾液,濾液作為待測(cè)液用氨基酸分析儀進(jìn)行測(cè)定。總氨基酸:不同的氨基酸采用不同的消解方法。酸水解測(cè)定賴(lài)氨酸、蘇氨酸、天冬氨酸、絲氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、精氨酸。堿水解測(cè)定色氨酸。氧化水解測(cè)定蛋氨酸、胱氨酸、半胱氨酸。
  2.3.5 肽
  肽=酸溶蛋白-游離氨基酸。
  2.4 碳水化合物
  同蛋白質(zhì),存在還原糖、可溶性總糖、淀粉之分。最主要是根據(jù)試驗(yàn)或生產(chǎn)需要選擇測(cè)定合適的檢測(cè)項(xiàng)目。在發(fā)酵飼料生產(chǎn)過(guò)程中,微生物需要利用可溶性還原糖或可溶性多糖通過(guò)酶解作用轉(zhuǎn)化的可溶性還原糖;因此在制定發(fā)酵飼料配方時(shí),需要考慮提供的糖能否滿(mǎn)足微生物的生長(zhǎng)代謝需求,進(jìn)而才能得到需要的代謝產(chǎn)物。而在最終的發(fā)酵飼料產(chǎn)品中,因涉及到發(fā)酵飼料如何在日糧中添加的問(wèn)題,比較關(guān)注對(duì)飼料中最終存在的還原糖、淀粉等。
  3 結(jié) 論
  發(fā)酵飼料的檢測(cè)項(xiàng)目,首先是衛(wèi)生指標(biāo),必須符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn);其次是理化指標(biāo),需根據(jù)生產(chǎn)廠(chǎng)家的質(zhì)量目標(biāo)而定;這兩類(lèi)項(xiàng)目需要在企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中明確標(biāo)注。最后是宣傳指標(biāo),可對(duì)有益營(yíng)養(yǎng)成分或產(chǎn)品的亮點(diǎn)指標(biāo)如氨基酸、酶活力、有機(jī)酸等進(jìn)行介紹,可附有第三方檢測(cè)機(jī)構(gòu)出具的檢測(cè)報(bào)告作為證明。發(fā)酵飼料的檢測(cè)方法,主要依據(jù)相關(guān)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn),但并不是全部參照方法,需要結(jié)合樣品的實(shí)際特性和需求進(jìn)行選擇。
 
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